凍結保存（二段階凍結）法

  1. プログラムフリーザーを用いて徐々に-40℃まで下げた後、液体窒素で-196℃まで急速凍結させる、二段階凍結法。
    DMSOと培地を遠心チューブ内で混合し、倍濃度のDMSO溶液を調整。氷で冷やしておく（混合時に発熱するため）。
    例：　3％で凍結する場合、６％DMSO溶液を作成
    チューブ 30本分　DMSO：960μl 培地：15,040μl
    20本分 720 11,280
    10本分　　　　　 360 5,640
  2. Ｐフリーザーの窒素タンクにポンプをセットし、気圧調節弁を閉めて圧を上げておく。
  3. クライオチューブにサンプルを500μlずつ分注。
  4. 調整済DMSO溶液を500μlずつ注入し混合、室温で15分間おく。
  5. その間に、Pフリーザーをセッティング。各チューブにバーコードシールを張る（または、サンプル名と日付を直接記入）。
  6. Pフリーザーの準備ができたら、ケーンにクライオチューブをセットして入れ、スタートさせる。
  7. 温度記録計のスイッチを入れる。
  8. 「－40℃まで毎分1℃づつ冷却し、－40℃で15分保持」のプログラムで運転。
  9. 75分で終了するので、その前にデュアー瓶に液体窒素を入れておく。
  10. プログラムが終了したら、素早くケーンからチューブを外して液体窒素につける（急速凍結法）。
  11. Pフリーザーはチャンバーを20℃に戻してから電源を切る。窒素ポンプの弁を開け、気圧が0まで下がったのを確認したらポンプを取り外す。
  12. クライオチューブを液体窒素保存槽（気相保存、約－160℃）内に収納。
  13. 解凍時、ウォーターバスを39.5℃に設定し暖めておく（37?40℃が良い）。
  14. ケーンやピンセットを用い、すばやく振りながら最後の氷が解けるまで解凍する。
  15. 培地で2回ほど洗浄して（サンプルが微小な場合は遠心機を使う）、培養チューブに植え込む。